由于莱姆病的症状多变，而且没有特异性，也可出现在其他的很多疾病中，如病毒感染、各种关节病变、肌肉疼痛 (纤维肌痛)、慢性疲乏综合症，甚至抑郁症，因此莱姆病经常被误诊。另外，蜱除了传播莱姆病外，也能传播其他疾病。
为了明确诊断，医生往往需要检测患者体内是否有针对伯氏疏螺旋体的抗体。检测方法包括：
- 酶联免疫吸附测定法 (ELISA)：使用 ELISA 检测伯氏疏螺旋体抗体是最常用于诊断莱姆病的方法。但由于这种检测有时候会出现假阳性结果，因此医生一般不将它作为唯一的诊断依据。
- 蛋白质印迹分析：该方法可检测患者体内是否有伯氏疏螺旋体特有的几种蛋白质的抗体。如果上述的 ELISA 检测结果呈阳性，医生通常会做这种蛋白质印迹分析来验证。
- 多聚酶链反应 (PCR)：该方法可检测出关节腔积液或脑脊液里是否有病原菌的DNA，但对于血液或尿液中的病菌DNA，其检测敏感性不高。因此，这种检查比较适用于那些慢性莱姆病关节炎患者，以及有神经系统症状的患者。
上述的三种方法一般在感染后数周 (让人体有足够的时间产生抗体后) 使用才能得出比较可靠的结果。即使如此，也不是 100% 准确。